作者：元小冬 1，张萍淑 1，刘妍 2，李妍 2，耿贺梅 3，王贺永 4，张淑清 4，刘青 2

单位：

1.063000 河北省唐山市，开滦总医院神经内科 2.063000 河北省唐山市，河北省神经生物机能重点实验室3.063000 河北省唐 山市，开滦总医院医院感染管理科 4.063000 河北省唐山市，开滦总医院检验科

关键词：

肺炎克雷伯菌；神经重症监护室；克隆株；全基因组测序；毒力基因

CLC：

DOI：

Funds：

2020 年度河北省创新能力提升计划项目——科技研发平台与新型研发机构建设专项（20567622H）；2020 年度唐 山市科学技术研究与发展计划（20130210D）

摘要：

背景 神经重症医学科（NICU）患者常存在意识及肢体运动障碍，多存在侵入性操作，免疫功能降低， 因此其是肺炎克雷伯菌（KP）高危感染人群。探索非多重耐药 KP 的致病毒力、传播特点对指导临床治疗、减少多重 耐药菌转化至关重要。目的 通过全基因组测序分析，了解 NICU 感染患者非多重耐药 KP 毒力基因分布与传播特征。 方法 收集 2015—2018 年开滦总医院收治的 93 例 NICU 感染患者的非多重耐药 KP 94 株，所有 KP 应用 K-B 法进行 抗菌药物敏感试验及脉冲场凝胶电泳法（PFGE）进行同源性分析，选出其中无同源性的 KP 3 株，其中 2015 年、2016 年、 2017 年各 1 株，分别编号为 P20、P39、P66；2018 年，选出与 P66 为同一流行克隆系的 KP 2 株，分别编号为 P90、 P91，且 P90 与 P91 为同一克隆株。将 5 株非多重耐药 KP 进行二代、三代全基因组测序，将所得的基因组测序结果 上传至 NCBI 的 prokaryotic annotation pipeline 系统进行基因组预测基因注释，并应用 BLAST 软件进行对比分析，获取 病原菌毒力因子数据库（VFDB）比对基因注释结果。结果 将 NICU 感染患者 5 株非多重耐药 KP 的基因组测序结果 与 VFDB 进行比对，结果显示，5 株非多重耐药 KP 中共筛选出 6 大类 52 种毒力基因，包括黏附类 17 种（32.7%）、 分泌系统类 15 种（28.8%）、铁吸收类 15 种（28.8%）、调节类 3 种（5.8%）、内毒素类 1 种（1.9%）、侵入类 1 种（1.9%）； 其中 P20 携带毒力基因 19 种（36.5%）、P39 携带毒力基因 18 种（34.6%）、P66 携带毒力基因 2 种（3.8%）、P90 携带毒力基因 47 种（90.4%）、P91 携带毒力基因 49 种（94.2%）。NICU 感染患者非多重耐药 KP 的基因注释结果 显示：（1）黏附类毒力基因：P90、P91 中均检出 fimA、fimB、fimC、fimE、fimF、fimG、fimH、fimI、ecpB、ecpE、 ecpR、mrkA、mrkB、mrkD、mrkF、yagZ/ecpA、fliY 基因各 1 个，P20、P39 中仅检出 1 个 fliY 基因，P66 未检出此类 毒力基因。（2）铁吸收类毒力基因：在同一克隆株 P90、P91 中均检出 fepB、fepC、fepD、fepG、entA、entB、entS、 iroE、ybtA、ybtX、sitB、sitC 基因各 1 个，P90 还检出 1 个 ybtT 基因，其同一流行克隆系 P66 检出 iucB、iroC 基因各 1 个，P20、P39 均未检出此类毒力基因。（3）分泌系统类毒力基因：P20、P39、P90、P91 中均检出 ECS88-3547、 pulB、pulD、pulH、pulI、pulJ、pulK、pulM、pulN、pulO、pulS 基因各 1 个，P20、P90、P91 均检出 1 个 EC55989- 3327 基因，P20、P39、P91 均检出 pulC、pulG 基因，P91 检出 1 个 EC55989-3335 基因，P66 未检出此类毒力基因。 （4）调节类毒力基因：P20、P39、P90、P91 中均检出 fur、PMI0229 基因各 1 个，P90、P91 还各检出 1 个 phoP 基因， P66 未检出此类毒力基因。（5）在 P20、P39、P90、P91 中均检出 1 个内毒素类毒力基因（kdsA 基因）和 1 个侵入 类毒力基因（Z1307 基因）。NICU 患者 5 株非多重耐药 KP 全基因组中，黏附类毒力基因表达的毒力因子包括Ⅰ型菌 毛（fimA、fimB、fimC、fimE、fimF、fimG、fimH、fimI）、Ⅲ型菌毛（mrkA、mrkB、mrkD、mrkF）、大肠杆菌菌毛 ECP（ecpB、ecpE、ecpR、yagZ/ecpA）、腹膜鞭毛 A Ⅰ 139（fliY）；铁吸收类毒力基因表达的毒力因子包括肠杆菌 素（entA、entB、entS、fepB、fepC、fepD、fepG）、耶尔西菌素（ybtA、ybtT、ybtX）、气杆菌素（iucB）、沙门菌素 （iroC、iroE）、铁 / 锰酶转运（sitB、sitC）；分泌系统类毒力基因表达的毒力因子包括Ⅱ型分泌系统（T2SS）（pulB、 pulC、pulD、pulG、pulH、pulI、pulJ、pulK、pulM、pulN、pulO、pulS）和Ⅵ型分泌系统（T6SS）（EC55989-3327、 EC55989-3335、ECS88-3547）；调节类毒力基因表达的毒力因子包括 Fur（fur）、PhoPQ（phoP）、ABC 转运蛋白通 透酶（PMI0029）；内毒素类毒力基因表达的毒力因子为LOS（kdsA）；侵入类毒力基因表达的毒力因子为OmpA（Z1307）。 结论 NICU 感染患者非多重耐药 KP 中携带着大量的致病毒力基因，主要为黏附类、铁吸收类、分泌系统类毒力基因， 还有少量的调节类、内毒素类、侵入类毒力基因。黏附类和铁吸收类毒力基因以克隆方式进行传播，这也是以克隆传 代的 KP 株具有产生更强致病毒力的遗传学基础。

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